Sequencing By Synthesis Priciple

在全外显子DNA文库Library制备完成并完成质检之后,就可以在illumina 测序仪上进行高通量测序了。illumina公司作为二代测序仪生产领先企业,自2006年进军基因测序市场以来,陆续发布了HiSeq,MiSeq,NextSeq,NovaSeq等一系列测序仪器。

illumina测序通过边合成边测序(SBS)的方法进行测序,核心是利用可逆终止的dNTP进行DNA延伸反应,通过四种碱基所发出不同荧光的颜色判读。

可逆终止dNTP聚合反应荧光变化
illumina测序准备

芯片Flowcell表面共价连接了两种DNA探针,与文库构建中DNA片段两侧加入的接头碱基互补,可以特异性地与之杂交结合。反复变性结合和PCR扩增,最终获得单条DNA链所产生的测序簇 ,用于扩大扫描时dNTP所产生的荧光信号。

Patterned Flowcell
测序前准备步骤
1、双链DNA文库变性结合至flowcell表面

依据碱基互补配对原则,双链DNA文库变性退火后,片段根据两端接头随机地结合至Flowcell内表面上的单链DNA探针上。

2、桥式PCR扩增

已杂交至探针上的DNA文库片段另一侧接头结合至相邻的另一互补探针上,添加DNA聚合酶,dNTPs等进行PCR反应,类似于Bridge。

3、重复变性产生DNA簇

重复变性、洗脱PCR扩增后,最终形成单个DNA片段的DNA测序簇。

4、去除反义链

测序开始之前需要先将反义链去除,只剩正向DNA链进行测序。这一步可由特定的化学反应去除反向引物上的特定基团。

5、加入测序引物,边合成边测序

加入DNA聚合酶和带荧光标记的dNTP,并且其3’末端是被叠氮基所修饰,导致DNA聚合反应不能继续进行。只能利用化学反应消除该基团以便DNA聚合反应可以继续进行(可逆终止DNA聚合反应)。

每步反应结束后利用激光对flowcell表面进行扫描获得荧光信息。

6、双端测序PE

如有必要可以进行双端测序,具体即利用PCR反应合成反向链,然后用特定化学试剂去除正向链即可。原理一样。

7、结束之后,软件根据对应位置的荧光信号,给出DNA片段碱基信息(fastq文件)。













测序数据生物信息学分析

Categories: 生物信息

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