全外显子测序(Whole Exome Sequencing, WES)相比全基因组测序(Whole Genome Sequencing, WGS)更加经济,是一种广泛使用的靶向测序方法。外显子(人类基因组的蛋白质编码区)占基因组的不到2%,但含有约85%的已知疾病相关变异体,使整个外显子测序成为全基因组测序的一种经济有效的替代方法。外显子序列的使用外显子丰富可以有效地识别编码变体的广泛应用,包括群体遗传学,遗传病和癌症研究。

WES整个实验步骤分为全外显子文库构建,Cluster桥式PCR扩增,上机扫描测序,测序数据生物信息分析四个部分。

全外显子测序优势

  • 广泛应用的突变识别
  • 实现编码区域的全面覆盖
  • 为全基因组测序提供了一种经济有效的替代方法(每个外显子的测序量为4-5GB,而整个人类基因组的测序量约为90GB)
  • 与全基因组方法相比,生成更小、更易于管理的数据集,以便更快、更容易地进行分析

完整的实验流程

人类全外显子文库构建

整个文库构建流程如图所示,这是Illumina Nextera Rapid Capture Exome Kit的实验流程图。除此之外还可以选择Agilent SureSelect Human All Exon 等试剂盒,原理类似,大致流程分为:设计外显子区域以及5’3’UTR区域捕获探针,与打断后的150bp~200bp的DNA文库片段进行杂交,再利用探针上生物素与带有链霉亲和素的磁珠结合,通过富集磁珠间接地获得人类全外显子测序文库。

  1. 测序DNA根据建库方法要求不同,转座酶要求起始量为50ng以上,可由患者外周血或组织细胞提取获得。
  2. 把基因组DNA进行超声打碎100~200bp,或使用转座酶Tn5处理生成300bp片段建成DNA文库。
  3. 两端加接头P5,P7,index1,2。
  4. 选取合适长度DNA片段,并扩增纯化。
  5. 与带有生物素的外显子探针库进行杂交。
  6. 利用生物素biotin与链霉亲和素的强结合能力,将带有链霉亲和素的磁珠与已结合目标文库的探针结合起来。
  7. 吸附磁珠,去除上清液。
  8. 洗脱掉磁珠上的DNA,PCR扩增文库。
  9. 鉴定文库质量,准备上机测序。













illumina上机测序

Categories: 生物信息

4 Comments

Anonymous · 2019年9月17日 at 10:17

开始搞学术了?

    Anonymous · 2019年9月17日 at 21:54

    实在不知道写什么了

      Anonymous · 2020年8月25日 at 09:58

      第一张图的流程是全基因组测序的吧

        Anonymous · 2020年8月25日 at 12:35

        NGS大致的框架

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